單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,生物素,-,親合素放大技術(shù),第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記,一、理化特性,二、親合素（或鏈酶親合素）的標(biāo)記,第一節(jié) 生物素的理化性質(zhì)與標(biāo)記一、活化生物素二、活化生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),第三節(jié) 生物素,-,親合素系統(tǒng)的特點(diǎn)一、靈敏度二、特異性三、穩(wěn)定性四、適用性五、其他,思考題,小結(jié),第四節(jié) 生物素,-,親合素系統(tǒng)的應(yīng)用一、生物素,-,親合素系統(tǒng)基本類型及原理二、生物素,-,親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用三、生物素,-,親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用四、生物素,-,親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用五、生物素,-,親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,維生素,H,動(dòng)、植物組織中廣泛,分布,卵黃和肝含量高,MW 244.31kD.,I,環(huán)為咪唑酮環(huán)，可與親合,素結(jié)合,環(huán)為噻吩環(huán)，,C2,上戊酸,側(cè)鏈的未端羧基是結(jié)合生,物大分子的唯一結(jié)構(gòu),I,咪唑酮環(huán),噻吩環(huán),羧基,第一節(jié) 生物素理化性質(zhì)與標(biāo)記,一、活化生物素,生物素側(cè)鏈的末,端羧基經(jīng)化學(xué)修,飾后制成帶各種,活性基團(tuán)的衍生,物,活化生物素,(,生物素化衍生物,),生物素活化,活化生物素易,與抗原、抗體,酶及核酸分子,中相應(yīng)基團(tuán)偶,聯(lián)形成生物素,化標(biāo)記物,標(biāo)記蛋白質(zhì),氨基,的活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì),醛基,的活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì),巰基,的活化生物素,標(biāo)記,核酸,的活化生物素,活化生物素,標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基的活化生物素,BNHS,分子可與蛋白質(zhì),賴氨酸的氨基形成肽鍵,BNHS,適用標(biāo)記抗體和,中性或偏堿性的蛋白質(zhì),生物素,N-,羥基丁二酰胺,碳二亞胺,生物素羥,基琥珀酰,亞胺酯（,BNHS,）,如何減小空間位阻？,長(zhǎng)臂活化生物素,（,BCNHS,）：,生物素和,N-,羥基丁二酰亞胺之間添,加了兩個(gè),6-,氨基已糖分子基團(tuán)，形,成連結(jié)臂，生物素與大分子基團(tuán)的,距離,標(biāo)記蛋白質(zhì)醛基的活化生物素,生物素酰肼,(BHZ),：,水合肼與生物素的合成物,主要用于標(biāo)記偏酸性糖蛋白,肼化生物胞素,(BCHZ),：生物素與賴氨酸連接,后，再與無(wú)水肼反應(yīng)而成。

除醛基外，,BCHZ,還可標(biāo)記氨基,標(biāo)記蛋白質(zhì)巰基的活化生物素,馬來(lái)酰亞胺,-,丙酰,-,生物胞素（,MPB),能特異地與蛋白質(zhì)巰基結(jié)合的活化,生物素,標(biāo)記核酸的活化生物素,光生物素,(photobiotin),側(cè)鏈上連接的芳香基疊氮物基團(tuán),經(jīng)光照后,變?yōu)榉枷?基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結(jié)合,形成,B-,核酸探針,生物素脫氧核苷三磷酸,（,Bio-dUTP,）,作為,TTP,的結(jié)構(gòu)類似物，可采用缺口移,位法摻入到雙鏈,DNA,中BNHS,和,BHZ,可直接標(biāo)記核酸，,但對(duì),堿基配對(duì),有影,響活化生物素通過(guò)側(cè)鏈與蛋白分子連接；,一個(gè)蛋白分子可被多個(gè)生物素標(biāo)記多價(jià)性；,對(duì),BNHS,多標(biāo)記抗體,BHZ,則多標(biāo)記微酸性抗原；,抗原、抗體標(biāo)記后活性不變；,可對(duì)標(biāo)記材料（如酶）標(biāo)記：堿性磷酸酶標(biāo)記后,活性將降低；,二、生物素標(biāo)記蛋白質(zhì),選擇活化生物素：,依抗原或抗體分子所帶可標(biāo)記基團(tuán),的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；,控制生物素：,蛋白質(zhì)比例,生物素：,IgG,用量比,(mg/mg),宜為,2:1,IgG,應(yīng)用濃度,0.5,5,g/ml,;,生物素,1,3,個(gè),/Ag,，,3,5,個(gè),/Ab,；,使用交聯(lián)臂減少空間阻力,第二節(jié) 親合素、鏈霉親合素的理化性質(zhì)與標(biāo)記,親合素,(avidin,AV),和鏈霉親合素,(streptavidin,SA),是生物素的天然特異性結(jié)合物。

而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標(biāo)記的物質(zhì)均可以同親合素（,AV,）或鏈酶親合素（,SA,）結(jié)合結(jié)構(gòu),四亞基糖蛋白 四肽鏈蛋白 無(wú)糖基,PI,10.5 6,結(jié)合位,色氨酸 色氨酸,生物素,4 4,Ka,10,15,10,15,活性,13,15 15,18,親合素（,A,）,鏈霉親合素,(SA),一、理 化 特 性,二、親合素,/,鏈霉親合素標(biāo)記,標(biāo)記物：,酶、膠體金,異硫氰酸熒光素（,FITC,）,HRP-AV(SA),過(guò)碘酸鈉、戊二醛,ABC/SABC,預(yù)制,AV(SAV)-Biotin,第三節(jié) 生物素,-,親合素系統(tǒng)的特點(diǎn),一、靈敏度,二、特異性,三、穩(wěn)定性,四、適用性,五、其他,第四節(jié) 生物素,-,親合素系統(tǒng)的應(yīng)用,生物素與親合素之間結(jié)合的親合力高、特異性強(qiáng)，各自均可以與各型大小分子結(jié)合，以及二者在結(jié)合反應(yīng)時(shí)具有的多級(jí)放大作用等優(yōu)越性，使,BAS,及其相關(guān)技術(shù)被廣泛應(yīng)用在各種標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中，尤其為標(biāo)記免疫檢測(cè)自動(dòng)化分析做出了極大的貢獻(xiàn)一、生物素,-,親合素系統(tǒng)基本類型及原理,BAB,法：,Ag+B,Ab Ag-Ab,B,A,Ag-Ab,B-A,B,E,Ag-Ab,B-A-B,E,特點(diǎn)：以游離,A,分別連接,B-Ab,和,B-E,BA,法,Ag+B,Ab Ag-Ab,B,A,E,Ag-Ab,B-A-B,E,特點(diǎn)：以,A-E/SA-E,代替,BAB,法中的,A,，省,卻了加,B-E,的步驟,3.,ABC,法,A+B,E A-B,E-ABC,Ag+B,Ab Ag-Ab,B,ABC,Ag-Ab,B-ABC,特點(diǎn),:,將,BAB,法中的,A,先與,B-E,結(jié)合，制備成復(fù)合物,ABC,二、生物素,-,親合素系統(tǒng)在酶免疫測(cè)定中的應(yīng)用,BAS,在,ELISA,中的應(yīng)用,生物素,-,親合素系統(tǒng)在均相酶免疫測(cè)定,三、生物素,-,親合素系統(tǒng)在熒光免疫技術(shù)中的應(yīng)用,BAS,用于熒光抗體技術(shù)，通常采用,BA,法，即用熒光素直接標(biāo)記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標(biāo)記的生物素（,BAB,法）或熒光標(biāo)記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。

四、生物素,-,親合素系統(tǒng)在放射免疫測(cè)定中的應(yīng)用,BAS,主要與免疫放射分析,(IRMA),檢測(cè)體系偶聯(lián)，用于對(duì)終反應(yīng)的放大（,BA,法）,BAS,也可用于,IRMA,反應(yīng)后,B,、,F,成分的分離,五、生物素,-,親合素系統(tǒng)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用,以生物素標(biāo)記核酸探針進(jìn)行的定位檢測(cè),用,BAS,制備的親和吸附劑進(jìn)行基因的分離純化,將免疫測(cè)定技術(shù)與,PCR,結(jié)合建立免疫,-PCR(immuno-PCR),用于抗原的檢測(cè),思考題,生物素的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是什么？,生物素通過(guò)什么結(jié)構(gòu)、形式與生物大分子相連結(jié)？,親合素或鏈霉親合素的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有何特點(diǎn)？,為什么親合素、鏈霉親合素具有,“,橋聯(lián),”,作用？,親合素、鏈霉親合素可以被哪些示蹤劑標(biāo)記？,為什么生物素親合素系統(tǒng)具有放大作用？,生物素與親合素或鏈霉親合素的結(jié)合是否與抗原抗體結(jié)合相同？,生物素親合素系統(tǒng)放大的是反應(yīng)過(guò)程還是單一檢測(cè)信號(hào)的能量？,生物素、親合素或鏈霉親合素如何與標(biāo)記免疫技術(shù)聯(lián)接？,如何將生物素鏈霉親合素放大系統(tǒng)用于所有雙位點(diǎn),ELISA?,小 結(jié),生物素,親合素（鏈霉親合素）系統(tǒng)具有的多級(jí)放大獨(dú)特效應(yīng)，可極大地提高分析測(cè)定的靈敏度；二者之間的高親和、高特異結(jié)合以及既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料的特性，使該系統(tǒng)在標(biāo)記免疫分析技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和適用性。

該系統(tǒng)有二種基本類型：以游離親合素為中間物，分別連接包含生物素化大分子的待檢反應(yīng)體系和標(biāo)記生物素的,BAB,法或,ABC,技術(shù)；另一類是直接用標(biāo)記親合素連接生物素化大分子反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)的,BA,法或,LAB,在生物素,親合素（鏈霉親合素）放大系統(tǒng)應(yīng)用中，無(wú)論采用酶、熒光素或發(fā)光物作為檢測(cè)示蹤劑，均是待測(cè)抗原與生物素化抗體反應(yīng)形成復(fù)合物后，再利用生物素與親合素間的多價(jià)放大結(jié)合特性，或直接與標(biāo)有示蹤劑的生物素結(jié)合（,BA,、,LAB,法），或依次與親合素（鏈霉親合素）、生物素示蹤標(biāo)記物反應(yīng)連接成聚合物（,BAB,、,ABC,法），最終使待測(cè)反應(yīng)信號(hào)被放大，提高檢測(cè)方法的靈敏度。