第十八章第十八章免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用首都醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系首都醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系第一節(jié)第一節(jié) 抗原或抗體的體外檢測(cè)抗原或抗體的體外檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)：antigen-antibody reaction是指抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)或體外發(fā)生的特異性結(jié)合的反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)：serological reaction指體外的抗原-抗體反應(yīng)一、抗原一、抗原-抗體反應(yīng)特點(diǎn)抗體反應(yīng)特點(diǎn)特異性：親和力、親合力、交叉反應(yīng)可逆性可見(jiàn)性階段性二、抗原二、抗原-抗體反應(yīng)影響因素抗體反應(yīng)影響因素電解質(zhì)酸堿度溫度 三、三、抗原抗原-抗體反應(yīng)類(lèi)型和檢測(cè)方法抗體反應(yīng)類(lèi)型和檢測(cè)方法 中和反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)補(bǔ)體參加的反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)酶免疫測(cè)定法免疫熒光法 放射免疫測(cè)定法（一）（一） 凝集反應(yīng)（凝集反應(yīng)（agglutination））1. 直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)： 顆粒性抗原+相應(yīng)抗體→凝集 玻片法：細(xì)菌及ABO血型鑒定 試管法：肥達(dá)氏反應(yīng) 抗原吸附于載體+相應(yīng)抗體→凝集 常用載體：乳膠顆粒、羊紅細(xì)胞2. 間接凝集反應(yīng)3. 間接凝集抑制試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn)將可溶性抗原與相應(yīng)抗體預(yù)先作用，再加入相應(yīng)的致敏顆粒。

妊娠診斷試驗(yàn)：檢測(cè)尿中的HCG4. 抗人球蛋白試驗(yàn)（抗人球蛋白試驗(yàn)（Coombs試驗(yàn)）試驗(yàn)）用途：檢測(cè)單價(jià)抗體直接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)結(jié)合在Rh+紅細(xì)胞上的單價(jià)抗體；間接Coombs試驗(yàn)：檢測(cè)游離的Rh單價(jià)抗體（二）（二） 沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)(precipitation) 可溶性抗原+相應(yīng)抗體→沉淀–單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：測(cè)Ig、補(bǔ)體含量–雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：–火箭電泳：Ag 置“－”極–對(duì)流免疫電泳：Ag置“－”極，Ab置“＋”極–免疫電泳：–免疫比濁法：環(huán)狀沉淀絮狀沉淀1. 1. 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)2. 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)3. 對(duì)流免疫電泳對(duì)流免疫電泳原理：將雙擴(kuò)與電泳技術(shù)結(jié)合在一起，測(cè)定可溶 性抗原 陰極 陽(yáng)極 （-） （+） 電泳 電滲 AgAb4. 火箭電泳火箭電泳將單向免疫擴(kuò)散與電泳技術(shù)結(jié)合，可快速測(cè)定標(biāo)本中可溶性抗原的含量。

5. 免疫電泳免疫電泳先電泳分離標(biāo)本中抗原成分，再沿電泳方向挖抗體槽，加抗體，進(jìn)行雙擴(kuò)用于血清蛋白及抗體成分的分析及抗原/抗體提取物純化鑒定6. 免疫比濁法免疫比濁法該技術(shù)是利用抗原－抗體復(fù)合物在液相中形成濁度來(lái)測(cè)量抗原含量的方法方法：透射光比濁法散射光比濁法免疫乳膠比濁法速率抑制免疫比濁法（三）補(bǔ)體參加的反應(yīng)（三）補(bǔ)體參加的反應(yīng)此類(lèi)反應(yīng)是利用抗體與紅細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合后，使反應(yīng)體系中補(bǔ)體激活導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象建立的補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)： 待測(cè)抗原＋待測(cè)抗體（待測(cè)的反應(yīng)系統(tǒng)） 補(bǔ)體 抗體＋紅細(xì)胞（指示系統(tǒng)）溶血空斑試驗(yàn)HLA血清學(xué)分型法：即補(bǔ)體依賴的微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)（四）免疫標(biāo)記技術(shù)抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)結(jié)合，定位、定量、定性測(cè)定標(biāo)記物：熒光素、酶、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、膠體金等類(lèi)型：免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、同位素標(biāo)記技術(shù)等1 . 酶免疫測(cè)定法酶免疫測(cè)定法是用酶標(biāo)記Ab進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)常用的酶：辣根過(guò)氧化酶、堿性磷酸酶常用底物：鄰苯二胺（OPD）常用方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 免疫組化法（（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA））夾心法（測(cè)抗原） 間接法（測(cè)抗體）ELISA(雙抗體夾心法雙抗體夾心法-測(cè)測(cè)Ag)（（2）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（（ ELISPOT ））用于效應(yīng)細(xì)胞分泌單一細(xì)胞因子的測(cè)定。

 （（3））BAS-ELISA生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）是一生物放大系統(tǒng)，利用親和素-生物素-酶的連接關(guān)系，追蹤生物素標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)酶催化底物顯色，檢測(cè)相應(yīng)的抗體或抗原，靈敏度高 （（4）免疫組化技術(shù)）免疫組化技術(shù)Immunohistochemisty Technique是用標(biāo)記的已知抗體與組織或細(xì)胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合發(fā)生反應(yīng)，對(duì)抗原進(jìn)行定位、定性或定量檢測(cè)的技術(shù)2. 免疫熒光法免疫熒光法(異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白)直接法直接法 ：：用已知熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)未知抗原間接法：間接法： 用熒光標(biāo)記的抗抗體，檢測(cè)未知的抗原/抗體補(bǔ)體法：補(bǔ)體法：3. 放射免疫測(cè)定（放射免疫測(cè)定（RIA））將放射性核素分析的高度靈敏性與抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)的技術(shù)，測(cè)定激素和藥物常用I125和I131快速，敏感（pg)，但污染環(huán)境，有一定的危害性4. 免疫膠體金技術(shù)（免疫膠體金技術(shù)（ICS））Immunological colloidal gold signature是用膠體金顆粒標(biāo)記抗體或抗原，用以檢測(cè)未知抗原或抗體的技術(shù)，可用于多種液相免疫測(cè)定和固相免疫分析。

免疫層析法：immunochromatography免疫層析法操作和原理免疫層析法操作和原理①首先將已知特異性抗體固定于硝酸纖維素膜上某一區(qū)帶；②測(cè)試時(shí)將上述硝酸纖維素膜一端浸入待檢樣品中（尿液或血清），通過(guò)毛細(xì)管作用樣品將沿膜向前移動(dòng)；③當(dāng)樣品進(jìn)入特異性抗體固定區(qū)帶時(shí)，若樣品中含有相應(yīng)抗原即可與該區(qū)帶抗體特異性結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)免疫膠體金所呈現(xiàn)的紫紅色條帶判定試驗(yàn)結(jié)果早孕診斷（硝酸纖維素膜診斷試紙制備）早孕診斷（硝酸纖維素膜診斷試紙制備）早孕診斷（硝酸纖維素膜診斷試紙制備）早孕診斷（硝酸纖維素膜診斷試紙制備） ①首先將膠體金致敏抗體—膠體金標(biāo)記的鼠抗人絨毛膜促性腺激素（HCG）特異性抗體，松弛附著在玻璃纖維上，再將上述玻璃纖維固定在硝酸纖維素膜G處；②將鼠抗人HCG特異性抗體固定在硝酸纖維素膜T處；③將兔抗鼠IgG抗體（二抗）固定在硝酸纖維素膜C處；④硝酸纖維素膜最下方A處（附吸水紙）是滴加待檢或接觸尿液部位，在硝酸纖維素膜最上方B處有吸水紙，有助于形成毛細(xì)管層析作用早孕診斷（原理早孕診斷（原理早孕診斷（原理早孕診斷（原理 ）））） 將待檢尿液滴加在檢測(cè)試紙A區(qū)，或?qū)z測(cè)試紙A區(qū)插入待檢尿液中，通過(guò)層析作用待檢尿液向B區(qū)移動(dòng)，流經(jīng)G區(qū)時(shí)將膠體金標(biāo)記HCG抗體從玻璃纖維上復(fù)溶，若待檢尿液中含有HCG，即形成膠體金標(biāo)記抗體-HCG復(fù)合物；上述復(fù)合物遷移至T區(qū)時(shí)，可被固相HCG抗體識(shí)別結(jié)合，形成固相HCG抗體-HCG-膠體金標(biāo)記抗體復(fù)合物，膠體金聚集呈現(xiàn)陽(yáng)性紫紅色檢測(cè)線；剩余膠體金標(biāo)記抗體遷移到C區(qū)與兔抗鼠IgG抗體（二抗）結(jié)合，膠體金聚集呈現(xiàn)紫紅色質(zhì)控線。

膠體金免疫層析雙抗夾心法試驗(yàn)原理示意圖膠體金免疫層析雙抗夾心法試驗(yàn)原理示意圖膠體金免疫層析雙抗夾心法試驗(yàn)原理示意圖膠體金免疫層析雙抗夾心法試驗(yàn)原理示意圖早孕診斷（結(jié)果分析）早孕診斷（結(jié)果分析）早孕診斷（結(jié)果分析）早孕診斷（結(jié)果分析）①測(cè)試紙條出現(xiàn)兩條紫紅色反應(yīng)線：為早孕陽(yáng)性；②測(cè)試紙條檢測(cè)線顏色弱于質(zhì)控線：為早孕弱陽(yáng)性；③測(cè)試紙條僅在質(zhì)控線呈現(xiàn)紫紅色條帶：為早孕陰性；④測(cè)試紙條質(zhì)控線處無(wú)紫色條帶出現(xiàn)：為試驗(yàn)無(wú)效5. 化學(xué)發(fā)光免疫分析（化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA））Chemiluminescence immunoassay標(biāo)記物：魯米諾等是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)6. 免疫印跡法（免疫印跡法（Western blotting)先將抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳分開(kāi)，再將分開(kāi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜上，然后放入含有抗體的溶液中，洗去未結(jié)合抗體，再加標(biāo)記的二抗，通過(guò)顯色或發(fā)光顯示結(jié)果第二節(jié)第二節(jié) 免疫細(xì)胞及其功能檢測(cè)免疫細(xì)胞及其功能檢測(cè)葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法: Before centrifugeAfter centrifugeFig.1Fig.2一、外周血一、外周血單個(gè)單個(gè)核細(xì)胞的分離核細(xì)胞的分離二、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離二、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離1. 玻璃粘附法2. 尼龍毛分離法3. E花結(jié)分離法T細(xì)胞羊紅細(xì)胞4. 免疫吸附分離法免疫吸附分離法（洗淘法）（洗淘法） （（immune magnetic bead, IMB）） 將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)在磁性微珠上，與細(xì)胞懸液作用后置于磁場(chǎng)中，借磁力的作用將磁珠結(jié)合的細(xì)胞分開(kāi)。

5. 免疫磁珠分離法免疫磁珠分離法6. 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）分離）分離法法細(xì)胞用熒光素標(biāo)記的抗體染色，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)T細(xì)胞總數(shù): 抗CD3 檢測(cè)CD4+/ CD8+T細(xì)胞: 抗CD4/CD8檢測(cè)B細(xì)胞: 抗SmIg三、三、淋巴細(xì)胞功能測(cè)定淋巴細(xì)胞功能測(cè)定（一）（一）T細(xì)胞功能測(cè)定：細(xì)胞功能測(cè)定：1. T細(xì)胞增殖試驗(yàn)：細(xì)胞增殖試驗(yàn)：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 觀察在有絲分裂原（PHA、Con A）或特異性抗原刺激下T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，測(cè)定細(xì)胞免疫功能用3H-TdR法、MTT法測(cè)T細(xì)胞增殖2. 遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)：遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮膚試驗(yàn)：例如OT試驗(yàn) （二）（二）B細(xì)胞功能測(cè)定細(xì)胞功能測(cè)定1. 血清免疫球蛋白含量測(cè)定2. 抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)3. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)抗體形成細(xì)胞測(cè)定試驗(yàn)溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn)溶血空斑形成細(xì)胞試驗(yàn)（三）細(xì)胞毒試驗(yàn)（三）細(xì)胞毒試驗(yàn) Tc和NK對(duì)其靶細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用 方法：方法：51Cr(鉻)釋放法 乳酸脫氫酶釋放法 凋亡細(xì)胞檢測(cè)法四、吞噬細(xì)胞功能測(cè)定四、吞噬細(xì)胞功能測(cè)定中性粒細(xì)胞趨化功能的測(cè)定中性粒細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞掌握掌握常見(jiàn)的凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)及其用途。

ELISA夾心法和間接法的步驟溶血空斑試驗(yàn)的方法和用途。