沉淀分離技術沉淀分離技術n沉淀和結晶的區(qū)別沉淀和結晶的區(qū)別:§形態(tài)形態(tài)§成分純度成分純度n 結晶結晶:同類分子或離子以規(guī)則排列形式析出；同類分子或離子以規(guī)則排列形式析出；n 沉淀沉淀:無序析出，純度遠低于結晶無序析出，純度遠低于結晶n操操作作方方式式可可分分連連續(xù)續(xù)法法或或間間歇歇法法兩兩種種，，規(guī)規(guī)模模較較小小時時，，常常采用間歇法采用間歇法n生生物物分分子子在在水水中中形形成成穩(wěn)穩(wěn)定定的的溶溶液液是是有有條條件件的的，，這這些就是溶液的各種理化參數(shù)些就是溶液的各種理化參數(shù)n任任何何能能夠夠影影響響這這些些條條件件的的因因素素都都會會破破壞壞溶溶液液的的穩(wěn)穩(wěn)定性n沉沉淀淀法法就就是是采采用用適適當當?shù)牡拇氪胧┦└母淖冏內(nèi)苋芤阂旱牡睦砝砘瘏?shù)數(shù)，，控控制制溶溶液液的的各各種種成成分分的的溶溶解解度度，，從從而而將將溶溶液液中中的的欲提取的成分和其它成分分開的技術欲提取的成分和其它成分分開的技術n沉淀法操作步驟沉淀法操作步驟 ：：①①加入沉淀劑加入沉淀劑②②沉淀劑的陳化，促進粒子生長；沉淀劑的陳化，促進粒子生長；③③離心或過濾，收集沉淀物離心或過濾，收集沉淀物n加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、加沉淀劑的方式和陳化條件對產(chǎn)物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響。

收率和沉淀物的形狀都有很大影響ü 沉淀能否發(fā)生；沉淀能否發(fā)生；ü 沉淀劑或沉淀條件下對活性結構是否有破壞作用；沉淀劑或沉淀條件下對活性結構是否有破壞作用；ü 沉淀劑是否容易除去；沉淀劑是否容易除去；ü 用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的沉淀劑是否對人體有害用于食品、醫(yī)藥產(chǎn)品的沉淀劑是否對人體有害 沉淀過程應考慮的問題沉淀過程應考慮的問題：：n沉淀技術分離生化產(chǎn)物的典型例子是沉淀技術分離生化產(chǎn)物的典型例子是蛋白質(zhì)的分離提取蛋白質(zhì)的分離提取§ 優(yōu)點優(yōu)點：設備簡單、成本低、原材料易得、：設備簡單、成本低、原材料易得、 便于小批量生產(chǎn)；便于小批量生產(chǎn)；§ 缺點缺點：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)，：所得沉淀物可能聚集有多種物質(zhì)， 或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑， 產(chǎn)品純度常比結晶法低，產(chǎn)品純度常比結晶法低， 過濾也較困難過濾也較困難eg. 從血漿中通過從血漿中通過5步沉淀生產(chǎn)純度高達步沉淀生產(chǎn)純度高達99%的免疫球蛋白的免疫球蛋白和和96%~99%的白蛋白。

的白蛋白圖圖1 利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖n沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點：沉淀法分離蛋白質(zhì)的特點：u生生產(chǎn)產(chǎn)前前期期可可使使原原料料液液體體體體積積很很快快減減小小10~50倍倍，，從從而而簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費用簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)費用；；u使中間產(chǎn)物保持在一個使中間產(chǎn)物保持在一個中性溫和的環(huán)境中性溫和的環(huán)境；；u可可及及早早將將目目標標蛋蛋白白從從其其與與蛋蛋白白水水解解酶酶混混合合液液中中分分離離出出來，來，避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性避免蛋白質(zhì)的降解，提高產(chǎn)物穩(wěn)定性；；u用用蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)沉沉淀淀法法作作為為色色譜譜分分離離的的前前處處理理技技術術，，可可使使色色譜分離使用的限制因素降低到最少譜分離使用的限制因素降低到最少§3.2 蛋白質(zhì)的溶解特性蛋白質(zhì)的溶解特性n蛋白質(zhì)的溶解行為是一個獨特的性質(zhì)，由其組成、蛋白質(zhì)的溶解行為是一個獨特的性質(zhì)，由其組成、構象以及分子周圍的環(huán)境所決定構象以及分子周圍的環(huán)境所決定n蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部蛋白質(zhì)在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的。

分是親水的，但其內(nèi)部大部分是疏水的n一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學上類似的大一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解分子蛋白質(zhì)更易溶解圖圖2 蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)分子表面的憎水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)性質(zhì)蛋白質(zhì)性質(zhì)溶液性質(zhì)溶液性質(zhì)分子大小分子大小溶劑可利用度（如：水）溶劑可利用度（如：水）氨基酸組成氨基酸組成 pH值值氨基酸序列氨基酸序列離子強度離子強度可離子化的殘基數(shù)可離子化的殘基數(shù)溫度溫度極性極性/非極性殘基比率非極性殘基比率極性極性/非極性殘基分布非極性殘基分布氨基酸殘基的化學性質(zhì)氨基酸殘基的化學性質(zhì)蛋白質(zhì)結構蛋白質(zhì)結構蛋白質(zhì)電性蛋白質(zhì)電性化學鍵性質(zhì)化學鍵性質(zhì)表表1 影響蛋白質(zhì)溶解度的參數(shù)影響蛋白質(zhì)溶解度的參數(shù)§3.3 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障：防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障：⑴⑴蛋白質(zhì)周圍的水化層（蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shell)hydration shell)可可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液⑵⑵蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用存在雙電層）蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。

存在雙電層） 因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和因此，可通過降低蛋白質(zhì)周圍的水化層和雙電層厚度（雙電層厚度（ζζ電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)電位）降低蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀定性，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀吸引力吸引力n顆粒間的相互作用顆粒間的相互作用n顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度nVan der Waals Van der Waals 力力nKeeson Keeson 引力（偶極力）引力（偶極力）nDebye Debye 引力引力 （誘導力）（誘導力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一種引力，因為所有（色散力）是最重要的一種引力，因為所有分子都是可以被極化的，所以它是普遍存在的分子都是可以被極化的，所以它是普遍存在的其他沉淀法其他沉淀法金屬沉淀法金屬沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法非離子型聚合物沉淀法非離子型聚合物沉淀法§3.4 蛋白質(zhì)沉淀方法蛋白質(zhì)沉淀方法有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法等電點沉淀法中性鹽鹽析法中性鹽鹽析法①①①①成本低，不需要特別昂貴的設備成本低，不需要特別昂貴的設備成本低，不需要特別昂貴的設備成本低，不需要特別昂貴的設備②②②②操作簡單、安全操作簡單、安全操作簡單、安全操作簡單、安全③③③③對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用一、中性鹽沉淀法（鹽析法）一、中性鹽沉淀法（鹽析法）鹽析：在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程鹽析：在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程鹽析：在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程鹽析：在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程 。

得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時間脫鹽得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時間脫鹽得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時間脫鹽得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時間脫鹽優(yōu)點優(yōu)點優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點缺點缺點鹽濃度鹽濃度Salting-in溶溶解解度度Salting-out 蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，分子中的－蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－、－NH2和－和－OH等親水基團，與極性水分子相互作用形成水化層，等親水基團，與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成親水膠體親水膠體親水膠體親水膠體，削弱了蛋白質(zhì)分子，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的作用力，之間的作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團越多，水化層越蛋白質(zhì)分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大度也越大 1、中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理、中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理親水膠體在水中的穩(wěn)定因素親水膠體在水中的穩(wěn)定因素 電電電電 荷荷荷荷 水化膜水化膜水化膜水化膜 + + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + ++ + + +等點電時的蛋白質(zhì)等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）（親水膠體）帶負電荷蛋白質(zhì)帶負電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）（親水膠體）脫水脫水脫水脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質(zhì)帶負電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陰離子陽離子陽離子堿堿酸酸酸酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)聚集沉淀聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）（親水膠體）堿堿+ + + ++ + + +水化膜水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子的親水性，所以加入大和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽后，量中性鹽后，奪走了水分子奪走了水分子，破，破壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域。

壞了水化膜，暴露出疏水區(qū)域同時又同時又中和了電荷中和了電荷，破壞了親水，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀選用鹽析用鹽的幾點考慮：選用鹽析用鹽的幾點考慮：n鹽析作用要強鹽析作用要強n鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽需有較大的溶解度n鹽析用鹽必須是惰性的鹽析用鹽必須是惰性的n來源豐富、經(jīng)濟來源豐富、經(jīng)濟2、中性鹽的選擇、中性鹽的選擇陰離子：陰離子： 檸檬酸根檸檬酸根-3>酒石酸根酒石酸根-3 >F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-陽離子：陽離子： Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+ Hofmeister對一系列離子沉淀蛋白質(zhì)的能力對一系列離子沉淀蛋白質(zhì)的能力進行排序，稱進行排序，稱Hofmeister序列序列，或感膠離子序或感膠離子序 常常用用于于蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)沉沉淀淀的的鹽鹽為為硫硫酸酸銨銨和和硫硫酸酸鈉鈉硫硫酸酸鈉鈉雖雖無無腐腐蝕蝕性性但但低低于于40400 0C C就就不不易易溶溶解解，，因因此此只只適適用用于于熱熱穩(wěn)穩(wěn)定定性性較較好好的的蛋蛋白質(zhì)的沉淀過程。

白質(zhì)的沉淀過程0℃℃20℃℃80℃℃100 ℃℃（（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（（1）溶解度大）溶解度大（（2）分離效果好）分離效果好（（3）不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結構的作用不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結構的作用4）價格便宜，廢液不污染環(huán)境價格便宜，廢液不污染環(huán)境最常用的鹽：最常用的鹽：硫酸銨硫酸銨緩沖能力弱，具腐蝕性，含緩沖能力弱，具腐蝕性，含N缺點缺點缺點缺點優(yōu)優(yōu)優(yōu)優(yōu)點點點點（（1）加入固體鹽法）加入固體鹽法3、、 鹽析的操作方法鹽析的操作方法適用：飽和度高，不增大溶液體積適用：飽和度高，不增大溶液體積加入硫酸銨固體的量：查表、計算加入硫酸銨固體的量：查表、計算查表時查表時查表時查表時注意溫注意溫注意溫注意溫度度度度飽和度飽和度：： 在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽濃在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽濃度（（1）加入固體鹽法）加入固體鹽法20℃℃25℃℃g ：加入固體硫酸銨的質(zhì)量：加入固體硫酸銨的質(zhì)量S2：所需達到的硫酸銨飽和度：所需達到的硫酸銨飽和度S1：原溶液的硫酸銨飽和度：原溶液的硫酸銨飽和度 （（（（2 2）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法）加入飽和溶液法 適用：蛋白質(zhì)溶液體適用：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高。

硫酸銨濃度不高 V：所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；：所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；V0：原溶液體積；：原溶液體積；S2：所需達到的硫酸銨飽和度；：所需達到的硫酸銨飽和度；S1：原溶液的硫酸銨飽和度原溶液的硫酸銨飽和度 優(yōu)點優(yōu)點 硫酸銨濃度變化連續(xù)，硫酸銨濃度變化連續(xù)，鹽析效果較好鹽析效果較好缺點缺點 硫酸銨飽和度的測定、硫酸銨飽和度的測定、計算工作手續(xù)繁瑣，計算工作手續(xù)繁瑣，而且透析袋容積有限、而且透析袋容積有限、鹽析速度慢、硫酸銨鹽析速度慢、硫酸銨耗費大 （（3）透析平衡法）透析平衡法 方法一方法一：取料液分成等體積幾份，冷卻至：取料液分成等體積幾份，冷卻至0℃0℃4、鹽析曲線的制作、鹽析曲線的制作 各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2 2倍體積的緩沖液中，測倍體積的緩沖液中，測定其中定其中總蛋白總蛋白和和目標蛋白目標蛋白濃度（或測定離心上清液）濃度（或測定離心上清液）以飽和度為橫坐標，沉淀（或上清液）中總蛋白和目標蛋白濃以飽和度為橫坐標，沉淀（或上清液）中總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線度為縱坐標，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度％硫酸銨飽和度％蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度％硫酸銨飽和度％方法二方法二各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2 2倍體積的緩沖液中，測倍體積的緩沖液中，測定其中定其中總蛋白總蛋白和和目標蛋白目標蛋白濃度濃度以飽和度為橫坐標，總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋以飽和度為橫坐標，總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質(zhì)溶解度曲線白質(zhì)溶解度曲線 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度％硫酸銨飽和度％蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶或酶活力活力硫酸銨飽和度％硫酸銨飽和度％5、鹽析的影響因素、鹽析的影響因素 S：離子強度為：離子強度為I時蛋白質(zhì)的溶解度；時蛋白質(zhì)的溶解度；S0：離子強度為：離子強度為0時蛋白質(zhì)的溶解度；時蛋白質(zhì)的溶解度；KS：鹽析常數(shù)。

鹽析常數(shù) 鹽析時，蛋白質(zhì)溶解度與中性鹽的離子強度的關系：鹽析時，蛋白質(zhì)溶解度與中性鹽的離子強度的關系： 當溶劑的溫度一定時，對當溶劑的溫度一定時，對于某一溶質(zhì)，于某一溶質(zhì)，S0是一常數(shù)是一常數(shù)β（溶解度常數(shù)）（溶解度常數(shù)） KS越大，有效成分溶解度隨鹽濃度增加而減小的程度越大越大，有效成分溶解度隨鹽濃度增加而減小的程度越大KS越大，分級范圍越小，鹽析效果越好越大，分級范圍越小，鹽析效果越好多價陰離子具有很高的多價陰離子具有很高的KS，但高價陽離子的存在反而降低，但高價陽離子的存在反而降低KS ；；大而不規(guī)則的蛋白分子大而不規(guī)則的蛋白分子KS越大KS主要取決于鹽的性質(zhì)：主要取決于鹽的性質(zhì)：KS幾種鹽的鹽析能力的排列次序：幾種鹽的鹽析能力的排列次序： 磷酸鉀磷酸鉀>硫酸鈉硫酸鈉>磷酸銨磷酸銨>檸檬酸鈉檸檬酸鈉>硫酸鎂硫酸鎂1——纖維蛋白纖維蛋白2——血紅蛋白血紅蛋白3——擬球蛋白擬球蛋白4——血清蛋白血清蛋白5——肌紅蛋白肌紅蛋白幾種蛋白鹽析時離子強度與溶解度的關系圖幾種蛋白鹽析時離子強度與溶解度的關系圖  在一定在一定pH、溫度條件下，改變離子強度溫度條件下，改變離子強度。

適用于早期粗提階段的分步分離適用于早期粗提階段的分步分離 在一定離子強度下，改變在一定離子強度下，改變pH、溫度適、溫度適于后期分離純化和精制于后期分離純化和精制硫酸銨鹽析法測定羧基肌紅蛋白：硫酸銨鹽析法測定羧基肌紅蛋白：蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度g/L硫酸銨飽和度硫酸銨飽和度%結果結果3058開始沉淀開始沉淀366開始沉淀開始沉淀306590%沉淀析出沉淀析出當?shù)鞍诐舛仍黾赢數(shù)鞍诐舛仍黾?0倍時，鹽析時倍時，鹽析時所需硫酸銨的飽和度約減小所需硫酸銨的飽和度約減小7% 適宜蛋白質(zhì)濃度是適宜蛋白質(zhì)濃度是2.5％～％～3.0％（％（25 mg/mL～～30mg/mL））  蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大改變改變pH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度遠離等電點處溶解度大，在等了蛋白質(zhì)的溶解度遠離等電點處溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時，電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近 在水或稀鹽溶液中測得的等電點在水或稀鹽溶液中測得的等電點與在高鹽溶液中測得的等電點結果可與在高鹽溶液中測得的等電點結果可能不一樣能不一樣 注意注意注意注意 溫度是影響溶解度的重要因素，對于多數(shù)無機鹽溫度是影響溶解度的重要因素，對于多數(shù)無機鹽和小分子有機物，溫度升高溶解度加大。

和小分子有機物，溫度升高溶解度加大 但對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離但對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的是隨溫度升高而增加的 在一般情況下，對蛋白質(zhì)鹽析的溫度要求不嚴格，在一般情況下，對蛋白質(zhì)鹽析的溫度要求不嚴格，可在室溫下進行但對于某些對溫度敏感的酶，要求可在室溫下進行但對于某些對溫度敏感的酶，要求在在0℃℃～～4℃℃下操作，以避免活力喪失下操作，以避免活力喪失 1）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；2）分段鹽析中，應考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化；）分段鹽析中，應考慮每次分段后蛋白質(zhì)濃度的變化；3）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心；離心；4）加入硫酸銨時應注意攪拌，避免局部過濃；）加入硫酸銨時應注意攪拌，避免局部過濃；5）硫酸銨使用前須用）硫酸銨使用前須用H2S處理，高濃度的硫酸銨溶液使用前處理，高濃度的硫酸銨溶液使用前需用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需需用氨水或硫酸調(diào)節(jié)至所需pH。

6、注意事項、注意事項  蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)等等電電點點沉沉淀淀法法是是基基于于不不同同蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)離離子子具具有有不不同同等等電電點點這這一一特特性性，，依依次次改改變變?nèi)苋芤阂簆HpH值值的的辦辦法法，，將將雜雜蛋蛋白白沉沉淀淀除除去去，，最后獲得目標產(chǎn)物最后獲得目標產(chǎn)物二、等電點沉淀法二、等電點沉淀法 （（1）適用于疏水性強的蛋白質(zhì)）適用于疏水性強的蛋白質(zhì)（（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大同時最低溶解度會有所增大 （（3）無機酸通常價格便宜，無毒）無機酸通常價格便宜，無毒（（4）蛋白質(zhì)對低）蛋白質(zhì)對低pH 敏感，易失活敏感，易失活未沉淀蛋白質(zhì)的分率未沉淀蛋白質(zhì)的分率pH對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響?利用等電點除雜蛋白時必須利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，，不然盲目使用十分危險不少蛋白質(zhì)與金屬離子結合后，等不然盲目使用十分危險不少蛋白質(zhì)與金屬離子結合后，等電點會發(fā)生偏移，故電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整PH值值。

?由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍子捎谠S多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因質(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想單獨使用此法分辨率較低，效果不理想例如：工業(yè)上生產(chǎn)胰島素例如：工業(yè)上生產(chǎn)胰島素粗提液粗提液調(diào)調(diào)PH8.0調(diào)調(diào)PH3.0去除堿性蛋白質(zhì)去除堿性蛋白質(zhì)去除酸性蛋白質(zhì)去除酸性蛋白質(zhì)胰島素胰島素三、有機溶劑沉淀法三、有機溶劑沉淀法 許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質(zhì)?加入溶劑后會加入溶劑后會使水溶液的介電常數(shù)降低使水溶液的介電常數(shù)降低，而使蛋白質(zhì)分，而使蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，導致凝集和沉淀子間的靜電引力增大，導致凝集和沉淀?蛋白質(zhì)的溶劑化蛋白質(zhì)的溶劑化，使原來和蛋白質(zhì)結合的水被溶劑所取，使原來和蛋白質(zhì)結合的水被溶劑所取代，從而降低了它們的溶解度代，從而降低了它們的溶解度?有機溶劑有機溶劑可能破壞了蛋白質(zhì)的某種鍵可能破壞了蛋白質(zhì)的某種鍵如氫鍵，使其空間如氫鍵，使其空間結構發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來包在內(nèi)部的疏結構發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來包在內(nèi)部的疏水基團暴露于表面并與有機溶劑的疏水基團結合形成疏水基團暴露于表面并與有機溶劑的疏水基團結合形成疏水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀。

水層，從而使蛋白質(zhì)沉淀機理分析進展機理分析進展 對某些具有生物活性的大分子容易引起變對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行性失活，操作需在低溫下進行優(yōu)點優(yōu)點優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點缺點缺點 ①①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀 ②②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）可用透析袋脫有機溶劑）2、有機溶劑的選擇和濃度的計算、有機溶劑的選擇和濃度的計算 不同有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率受多方面的影響，需通過不同有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效率受多方面的影響，需通過試驗加以選擇大致上以試驗加以選擇大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次 前提：能與水互溶前提：能與水互溶V = V = 需加入需加入需加入需加入100100％濃度有機溶劑的體積％濃度有機溶劑的體積％濃度有機溶劑的體積％濃度有機溶劑的體積V V0 0 = = 原溶液體積原溶液體積原溶液體積原溶液體積S S1 1 = = 原溶液中有機溶劑的濃度原溶液中有機溶劑的濃度原溶液中有機溶劑的濃度原溶液中有機溶劑的濃度S S2 2 = = 所要求達到的有機溶劑的濃度所要求達到的有機溶劑的濃度所要求達到的有機溶劑的濃度所要求達到的有機溶劑的濃度 離子強度離子強度 3、有機溶劑沉淀的影響因素、有機溶劑沉淀的影響因素 溫度溫度 樣品濃度樣品濃度 pHpH值值 有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃攪拌以免局部過濃攪拌以免局部過濃攪拌以免局部過濃 通常使用通常使用通常使用通常使用5mg/mL5mg/mL5mg/mL5mg/mL～～～～20mg/mL20mg/mL20mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度的蛋白質(zhì)初濃度的蛋白質(zhì)初濃度的蛋白質(zhì)初濃度樣品穩(wěn)定的樣品穩(wěn)定的樣品穩(wěn)定的樣品穩(wěn)定的pHpHpHpH值范圍內(nèi)，等電點附近值范圍內(nèi)，等電點附近值范圍內(nèi)，等電點附近值范圍內(nèi)，等電點附近通常溶液中鹽濃度以不超過通常溶液中鹽濃度以不超過通常溶液中鹽濃度以不超過通常溶液中鹽濃度以不超過5 5 5 5％為宜％為宜％為宜％為宜 四、非離子多聚物沉淀法四、非離子多聚物沉淀法 20世世紀紀60年年代代非非離離子子型型聚聚合合物物開開始始用用于于分分離離血血纖纖維維蛋蛋白白原原和和免免疫疫球球蛋蛋白白，，從從此此高高相相對對分分子子質(zhì)質(zhì)量量非非離離子子聚聚合合物物沉沉淀淀蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的方方法法被被廣廣泛泛使使用用，，如如 ：： 聚聚 乙乙 二二 醇醇 （（ PEG）） 、、 聚聚 乙乙 烯烯 吡吡 咯咯 烷烷 酮酮（（PVP）、葡聚糖）、葡聚糖等。

等 u①①沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀共沉淀作用u②②由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水脫水而發(fā)而發(fā)生沉淀u③③聚合物與生物大分子之間聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合物以氫鍵相互作用形成復合物，，在重力作用下形成沉淀析出在重力作用下形成沉淀析出u④④通過通過空間位置排斥空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀一起而發(fā)生沉淀非離子多聚物沉淀蛋白的原理非離子多聚物沉淀蛋白的原理 ? ①①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性操作條件溫和，不易引起生物大分子變性? ②②沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀即可以沉淀相當多的生物大分子相當多的生物大分子? ③③沉淀后有機聚合物較難去除沉淀后有機聚合物較難去除 特特 點：點： 1）選用）選用兩種水溶性非離子多聚物兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離系，不等量分配，而造成分離2）選用）選用一種水溶性非離子多聚物一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。

在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出方方 法法  聚聚電電解解質(zhì)質(zhì)是是含含有有重重復復離離子子化化基基團團的的水水溶溶性性聚聚合合物物，，可可用用于于蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)沉沉淀淀的的聚聚電電解解質(zhì)質(zhì)有有聚聚丙丙烯烯酸酸、、聚聚乙乙烯烯亞亞胺胺、、羧羧甲甲基纖維素和離子型多糖基纖維素和離子型多糖如肝素等如肝素等沉淀機理沉淀機理五、聚電解質(zhì)沉淀法五、聚電解質(zhì)沉淀法 蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)分分子子的的相相反反電電荷荷與與聚聚電電解解質(zhì)質(zhì)結結合合，，形形成成一一個個多多分分子子絡絡合合物物，，當當絡絡合合物物超超過過游游離離蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)的的溶溶解解度度極極限限值值時時，，就發(fā)生沉淀就發(fā)生沉淀六、生成鹽復合物沉淀法六、生成鹽復合物沉淀法 金屬復合鹽法金屬復合鹽法有機鹽法有機鹽法無機復合鹽法無機復合鹽法u能與能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強烈強烈結合的金屬離子，如：結合的金屬離子，如：Mn2+、、Fe2+、、Co2+、、Ni2+、、Cu2+、、Zn2+、、Cd2+；；u能與能與羧酸結合而不與含氮化合物結合羧酸結合而不與含氮化合物結合的金屬離子，如：的金屬離子，如：Ca2+、、Ba2+、、Mg2+、、Pb2+；；u與與巰基化合物巰基化合物強烈結合的金屬離子，如：強烈結合的金屬離子，如：Hg2+、、Ag+、、Pb2+。

金屬離子沉淀蛋白質(zhì)可分為三類：金屬離子沉淀蛋白質(zhì)可分為三類：實際使用時，金屬離子的濃度常為實際使用時，金屬離子的濃度常為0.02 mol/LZnZn2+2+沉淀尿激酶沉淀尿激酶有機鹽法有機鹽法無機復合鹽法無機復合鹽法含氮有機酸如苦味酸、苦酮含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機分子的酸、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉堿性功能團形成復合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去淀析出，沉淀后用乙醚除去有機酸 如細胞色素如細胞色素C用用45%硫酸銨除雜后，硫酸銨除雜后，用用20% TCA即可將即可將其沉淀 如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等可加入乙醚或采用離子交換除去無機鹽可加入乙醚或采用離子交換除去無機鹽 七、其他沉淀法七、其他沉淀法 1、選擇性變性法、選擇性變性法 酸堿變性酸堿變性酸堿變性酸堿變性 熱變性熱變性熱變性熱變性表面活性劑變性表面活性劑變性表面活性劑變性表面活性劑變性 有機溶劑變性有機溶劑變性有機溶劑變性有機溶劑變性p選擇一定的條件使溶液中存在的某些選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白雜蛋白等雜質(zhì)變性等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為選擇選擇性變性沉淀法。

性變性沉淀法2、親和沉淀、親和沉淀 利用蛋白質(zhì)與特定的生物或合成的分子之間高度專一利用蛋白質(zhì)與特定的生物或合成的分子之間高度專一的作用而設計出來的一種特殊選擇性的分離技術，其沉淀原的作用而設計出來的一種特殊選擇性的分離技術，其沉淀原理是理是依據(jù)依據(jù)“吸附吸附”有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小有特殊蛋白質(zhì)的聚合物的溶解度的大小原理原理原理原理引導產(chǎn)生沉淀的方法有：引導產(chǎn)生沉淀的方法有：u離子交聯(lián)離子交聯(lián)u加入帶相反電荷的聚合物加入帶相反電荷的聚合物u加入帶相反電荷的疏水基團加入帶相反電荷的疏水基團u改變改變pH值，誘導產(chǎn)生疏水沉淀值，誘導產(chǎn)生疏水沉淀u溫度誘導產(chǎn)生沉淀溫度誘導產(chǎn)生沉淀配基配基-載體復合物與目的蛋白質(zhì)的分離載體復合物與目的蛋白質(zhì)的分離基本過程：基本過程：親和結合親和結合 洗洗 滌滌 初始階段：將一個目標蛋白質(zhì)初始階段：將一個目標蛋白質(zhì)與鍵合在可溶性載體上的親和與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡合成沉淀；配體絡合成沉淀；所得沉淀物用一種適當?shù)乃贸恋砦镉靡环N適當?shù)木彌_溶液進行洗滌，洗去緩沖溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質(zhì)可能存在的雜質(zhì)用一種適當?shù)挠靡环N適當?shù)脑噭⒛繕说霸噭⒛繕说鞍踪|(zhì)從配體中白質(zhì)從配體中離解出來離解出來§3.4 核酸的沉淀方法核酸的沉淀方法 核酸分離純化應維持在核酸分離純化應維持在0-4℃℃的低溫的低溫條件下，條件下，以防止核酸的變性和降解。

以防止核酸的變性和降解 為防止核酸酶引起的水解作用，可加入為防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二十二烷基硫酸鈉烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、、8-羥羥基喹啉、檸檬酸鈉基喹啉、檸檬酸鈉等以抑制核酸酶的活性等以抑制核酸酶的活性ü有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法ü等電點沉淀法等電點沉淀法ü鈣鹽沉淀法鈣鹽沉淀法ü溶劑沉淀法溶劑沉淀法常用的沉淀分離法有：常用的沉淀分離法有：1 1、有機溶劑沉淀法、有機溶劑沉淀法 由于核酸都不溶于有機溶劑，所以由于核酸都不溶于有機溶劑，所以可在核酸提取液中加可在核酸提取液中加入乙醇、異丙醇或入乙醇、異丙醇或2-2-乙氧基乙醇，使乙氧基乙醇，使DNADNA或或RNARNA沉淀下來沉淀下來核酸沉淀的形狀與其相對分子質(zhì)量密切相關：核酸沉淀的形狀與其相對分子質(zhì)量密切相關： 相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量>106Da>106Da的雙鏈的雙鏈DNADNA可以可以絲狀纖維絲狀纖維纏繞在玻棒纏繞在玻棒上；上； 相對分子質(zhì)量稍小的雙鏈相對分子質(zhì)量稍小的雙鏈DNADNA或單鏈或單鏈DNADNA、、RNARNA則以則以凝膠形凝膠形式式存在。

存在 這些核酸經(jīng)離心后存在于沉淀中，用這些核酸經(jīng)離心后存在于沉淀中，用70%70%乙醇乙醇洗滌，除去洗滌，除去其它鹽和小分子物質(zhì)，干燥后即為核酸制品其它鹽和小分子物質(zhì)，干燥后即為核酸制品 2 2、等電點沉淀法、等電點沉淀法脫氧核糖核蛋白脫氧核糖核蛋白的等電點為的等電點為pH 4.2；；核糖核蛋白核糖核蛋白的等電點力的等電點力pH 2.0-2.5；；tRNA的等電點為的等電點為pH 5 3、鈣鹽沉淀法、鈣鹽沉淀法核酸提取液核酸提取液核酸提取液核酸提取液10%10%氯化鈣氯化鈣氯化鈣氯化鈣鈣鹽形式鈣鹽形式鈣鹽形式鈣鹽形式1/51/5體積的乙醇體積的乙醇體積的乙醇體積的乙醇DNADNADNADNA鈣鹽沉淀鈣鹽沉淀鈣鹽沉淀鈣鹽沉淀4、選擇性溶劑沉淀法、選擇性溶劑沉淀法 ①①在核酸提取液中加入氯仿在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩辛醇，振蕩一段時間，使一段時間，使蛋白質(zhì)在氯仿蛋白質(zhì)在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀水界面上形成凝膠狀沉淀而離心而離心除去，除去，核酸仍留在水溶液中核酸仍留在水溶液中 ②②在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，水溶液提取液中，DNA和和RNA都進入水層都進入水層，而，而蛋白質(zhì)沉淀于蛋白質(zhì)沉淀于苯酚層中苯酚層中被分離除去。

被分離除去 ③③在在DNA與與RNA的混合液中，用的混合液中，用異丙醇選擇性地沉淀異丙醇選擇性地沉淀DNA而與而與留在溶液中的留在溶液中的RNA分離 沉淀法應用沉淀法應用n利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純蛋白與免疫球蛋利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純蛋白與免疫球蛋白的工藝白的工藝n檸檬酸的生產(chǎn)檸檬酸的生產(chǎn)n萃取萃取 一沉淀法提取分離茶多酚一沉淀法提取分離茶多酚標標準準沉沉淀淀法法回回收收檸檸檬檬酸酸流流程程圖圖加熱到加熱到7070度度。