培養(yǎng)基適用性檢查驗(yàn)證方案 文件編號：VMP-VV-501-00 起 草 人： 審 核 人： 批 準(zhǔn) 人： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日.驗(yàn)證立項(xiàng)申請表 申請部門質(zhì)量部申請日期 年 月 日驗(yàn)證對象培養(yǎng)基要求完成日期 年 月 日驗(yàn)證原因微生物驗(yàn)證驗(yàn)證類別微生物驗(yàn)證為了確認(rèn)所采用細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)和控制菌檢查的培養(yǎng)基是否符合微生物限度檢查法的規(guī)定要求，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性 申請部門負(fù)責(zé)人簽名： 日期：質(zhì)量部意見 簽名： 日期：驗(yàn)證方案編號VMP-VV-501-00驗(yàn)證報告編號VMP-VV-501REP-00負(fù)責(zé)人意見 簽名： 日期：驗(yàn)證小組成員部門姓名職務(wù)備注：驗(yàn)證方案審批表審批程序部門負(fù)責(zé)人簽名日期備注起草 審核批準(zhǔn)負(fù)責(zé)人備注1.概述 通過驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的培養(yǎng)基適合于細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定及控制菌的檢查，根據(jù)特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)2.驗(yàn)證目的及范圍為了確認(rèn)所采用細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)和控制菌檢查的培養(yǎng)基是否符合微生物限度檢查法的規(guī)定要求，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性3.驗(yàn)證風(fēng)險評估對于本次驗(yàn)證的執(zhí)行進(jìn)行了如下的風(fēng)險分析：嚴(yán)重程度 S可能性 P可檢測 D風(fēng)險優(yōu)先級 RPN = S×P×D1低1低1高RPN≤7低可以接受，無需采取措施2中2中2中16≥RPN≥8中一定程度上接受，但應(yīng)按風(fēng)險優(yōu)先級采取措施盡可能降低3高3高3低RPN＞16或嚴(yán)重程度＝4高不能接受，盡快采取措施降低4關(guān)鍵4極高4極低步驟/單元危害S可能原因/程序失敗P現(xiàn)行控制DRPN需采取措施SPDRPN培訓(xùn)驗(yàn)證部分項(xiàng)目出現(xiàn)偏差或漂移3方案培訓(xùn)不到位，方案的執(zhí)行者不熟悉方案內(nèi)容2嚴(yán)格執(zhí)行經(jīng)批準(zhǔn)的驗(yàn)證報告進(jìn)行培訓(xùn)，并考核合格318確認(rèn)按照批準(zhǔn)的方案培訓(xùn)，培訓(xùn)者均熟練掌握所培訓(xùn)內(nèi)容1122檢驗(yàn)過程操作不當(dāng)未達(dá)到設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)，驗(yàn)證失敗3未遵循培養(yǎng)基適用性檢查檢查操作規(guī)程，未嚴(yán)格遵循方案規(guī)定方法2制定培養(yǎng)基適用性檢查檢查操作規(guī)程，并對規(guī)程及設(shè)立的驗(yàn)證方法培訓(xùn)，按規(guī)程及方案要求進(jìn)行操作。

318確認(rèn)培養(yǎng)基適用性檢查檢查操作規(guī)程已制定并批準(zhǔn)，確認(rèn)人員已培訓(xùn)；確認(rèn)操作規(guī)程適用性11224.驗(yàn)證前準(zhǔn)備4.1驗(yàn)證人員培訓(xùn)：驗(yàn)證報告起草人有責(zé)任在方案批準(zhǔn)后（且在驗(yàn)證實(shí)施前）對本次驗(yàn)證相關(guān)人員進(jìn)行培訓(xùn)培訓(xùn)人員記錄見附件14.2將所有的平皿和稀釋劑都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)的滅菌程序消毒，以確保其對試驗(yàn)的結(jié)果沒有影響4.3儀器與器具：恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器、凈化工作臺、無菌培養(yǎng)皿、無菌移液管 5.驗(yàn)證內(nèi)容5.1測試環(huán)境條件要求所有檢查在環(huán)境潔凈度C級下的局部A級潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)隔離系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，其全過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，能防止微生物污染5.2計數(shù)培養(yǎng)基5.2.1驗(yàn)證用菌種及培養(yǎng)基：5.2.1.1來源： 食品藥品檢驗(yàn)所 5.2.1.2菌落計數(shù)用菌種菌種名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌(Escherichia coli) [CMCC（B）44 102]E-金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC（B）26 003]S-枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) [CMCC（B）63 501]B-白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC (F) 98 001 ]C-黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]A-注：編號由菌種首字母-傳代代數(shù)-配制日期組成。

5.2.2培養(yǎng)基及其制備方法：取市售的脫水培養(yǎng)基，分別按照規(guī)定方法進(jìn)行配制后灌裝于潔凈的三角燒瓶中，然后加塞滅菌，在實(shí)驗(yàn)前加溫熔化備用培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基批號配制日期有效期至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基5.2.3菌液制備5.2.3.1接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)液1ml，加0.9％無菌氯化鈉溶液至10ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6～10-7，使菌數(shù)約為50～100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用5.2.3.2接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時，取此培養(yǎng)液1ml，加0.9％無菌氯化鈉溶液至10ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6～10-7，使菌數(shù)約為50～100cfu/ml，做活菌計數(shù)備用5.2.3.3接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7天的用3～5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾絲的無菌毛細(xì)吸管）至無菌試管中，取1ml加含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液至10ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6,制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液備用。

5.2.4驗(yàn)證方法：5.2.4.1試驗(yàn)組：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml，分別注入無菌平皿中，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)、觀察菌落情況；取白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分別注入無菌平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)、觀察菌落情況測定結(jié)果見附件25.2.4.2對照組：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml，分別注入無菌平皿中，立刻傾注營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)、觀察菌落情況；取白色念珠菌、黑曲霉各1ml，分別注入無菌平皿中，立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)、觀察菌落情況測定結(jié)果見附件25.2.4.3菌回收率計算： ;Jt*試驗(yàn)組的菌回收率（%）=???（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)/ 對照組平均菌落數(shù)）×100% `h
12 ?5.2.5判定標(biāo)準(zhǔn)：菌回收率均應(yīng)不低于70%，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。

5.2.6結(jié)論：對計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查的驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行評價和總結(jié)5.3控制菌培養(yǎng)基適用性檢查：5.3.1驗(yàn)證用菌種：5.3.1.1來源： 食品藥品檢驗(yàn)所 5.3.1.2驗(yàn)證用菌種菌種名稱內(nèi)控編號大腸埃希菌(Escherichia coli) [CMCC（B）44 102]E-金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC（B）26 003]S-5.3.1.3培養(yǎng)基及其制備方法：取市售的脫水培養(yǎng)基，分別按照規(guī)定的方法進(jìn)行配制后灌裝于潔凈的三角燒瓶中，然后加塞滅菌在實(shí)驗(yàn)前加溫熔化備用培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基批號配制日期有效期至膽鹽乳糖培養(yǎng)基MUG培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基MUG對照培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵對照培養(yǎng)基5.3.2菌液制備：接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時，取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液至10ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，使細(xì)菌數(shù)約為500～1000cfu/ml5.3.3驗(yàn)證方法：5.3.3.1促生長能力培養(yǎng)基：取大腸埃希菌各0.1ml，分別涂布于膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基和乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基上，在30～35℃培養(yǎng)18小時，觀察菌落情況。

測定結(jié)果見附件35.3.3.2抑制能力培養(yǎng)基：取金黃色葡萄球菌各0.2ml，分別涂布于膽鹽乳糖培養(yǎng)基和乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基上，在30～35℃培養(yǎng)18小時，觀察菌落情況測定結(jié)果見附件35.3.3.3指示能力培養(yǎng)基：取大腸埃希菌各0.2ml，分別涂布于乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基及其對照培養(yǎng)基上，在30～35℃培養(yǎng)18小時，觀察菌落情況測定結(jié)果見附件35.3.4判定標(biāo)準(zhǔn)：5.3.4.1促生長能力培養(yǎng)基：試驗(yàn)培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基生長的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致5.3.4.2抑制能力培養(yǎng)基：試驗(yàn)菌均不得生長5.3.4.3指示能力培養(yǎng)基：試驗(yàn)培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)一致5.3.5結(jié)論：對控制菌培養(yǎng)基適用性檢查的驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行評價和總結(jié)6. 變更和偏差處理： 驗(yàn)證過程中如果出現(xiàn)偏差和變更，應(yīng)立即通知驗(yàn)小組對偏差和變更進(jìn)行詳細(xì)記錄，分析偏差產(chǎn)生的根本原因并提出解決方法所有偏差和變更得到有效處理后，驗(yàn)證方可進(jìn)入下一步驟偏差處理單和變更單經(jīng)過批準(zhǔn)后其原件必須附在驗(yàn)證報告中見附件47. 驗(yàn)證結(jié)果評定及結(jié)論： 質(zhì)量部負(fù)責(zé)收集各項(xiàng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，起草驗(yàn)證報告，報驗(yàn)證委員會。

驗(yàn)證委員會負(fù)責(zé)對驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)行綜合評審，做出驗(yàn)證結(jié)論，發(fā)放驗(yàn)證證書，確認(rèn)培養(yǎng)基適用性檢查情況見附件58.擬定再驗(yàn)證周期： 驗(yàn)證小組根據(jù)驗(yàn)證情況，擬定再驗(yàn)證周期，報驗(yàn)證領(lǐng)導(dǎo)小組審批9.會審及批準(zhǔn) 會 審： 批 準(zhǔn)：附件1培訓(xùn)人員記錄表部 門培訓(xùn)人員簽名簽到日期培訓(xùn)師簽名日 期附件2 營養(yǎng)瓊脂計數(shù)。