現(xiàn) 代 分 子 生 物 學(xué) 課 程 論 文題 目 基因敲除技術(shù) 班 別 生物技術(shù)10-2學(xué)號(hào) 10114040220 姓 名 陳嘉杰 成 績(jī) 基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展要摘 基因敲除是自80年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)此后經(jīng)歷了近20年的推廣和應(yīng)用，直到2007年10月8日，美國(guó)科學(xué)家馬里奧?卡佩奇（Mario Capecchi）和奧利弗?史密西斯（Oliver Smithies）、英國(guó)科學(xué)家馬丁?埃文斯（Martin Evans）因?yàn)樵诶门咛ジ杉?xì)胞對(duì)小鼠基因金星定向修飾原理方面的系列發(fā)現(xiàn)分享了2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)基因敲除技術(shù)從此得到關(guān)注和肯定，并對(duì)醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究做出了重大貢獻(xiàn)本文就基因敲除的研究進(jìn)展作一個(gè)簡(jiǎn)單的綜述關(guān)鍵詞 基因敲除、RNAi、生物模型、同源重組前言 基因敲除又稱(chēng)基因打靶，該技術(shù)通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改制，具有轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。

應(yīng)用DNA同源重組技術(shù)將滅活的基因?qū)胄∈笈咛ジ杉?xì)胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再篩選出已靶向滅活的細(xì)胞，微注射入小鼠囊胚該細(xì)胞參與胚胎發(fā)育形成嵌合型小鼠，再進(jìn)一步傳代培育可得到純合基因敲除小鼠基因敲除小鼠模型的建立使許多與人類(lèi)疾病相關(guān)的新基因的功能得到闡明，使現(xiàn)代生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展上述起源于80年代末期的基因敲除技術(shù)為第一代技術(shù)，屬完全性基因敲除，不具備時(shí)間和區(qū)域特異性關(guān)于第二代區(qū)域和組織特異性基因敲除技術(shù)的研究始于1993年Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先報(bào)道了第一個(gè)腦區(qū)特異性的基因敲除動(dòng)物，被譽(yù)為條件性基因敲除研究的里程碑該技術(shù)以Cre/LoxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，Cre在哪種組織細(xì)胞中表達(dá)，基因敲除就發(fā)生在哪種組織細(xì)胞中2000年Shimizu等[2]于《Science》報(bào)道了以時(shí)間可調(diào)性和區(qū)域特異性為標(biāo)志的第三代基因敲除技術(shù)，其同樣以Cre/LoxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用四環(huán)素等誘導(dǎo)Cre的表達(dá)該技術(shù)使目的基因的敲除在時(shí)間上可人為控制，避免了死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡等現(xiàn)象的出現(xiàn) 2004年該實(shí)驗(yàn)室Cui等又報(bào)道了第四代基因工程技術(shù)，即可誘導(dǎo)的區(qū)域性蛋白質(zhì)敲除技術(shù)，用這一技術(shù)構(gòu)建的模式動(dòng)物可在幾分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)性地激活或敲除特定蛋白質(zhì)的功能，從根本上改變了前三代基因敲除技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)代謝速度的內(nèi)在依賴(lài)性，達(dá)到空前的時(shí)間精度，成為目前功能基因組和功能蛋白質(zhì)組研究最先進(jìn)的工具之一。

1. 基因敲除技術(shù)簡(jiǎn)介基因敲除是自80年代末以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，除了同源重組外，新的原理和技術(shù)也逐漸被應(yīng)用，比較成功的有基因的插入突變和iRNA，它們同樣可以達(dá)到基因敲除的目的2．實(shí)現(xiàn)基因敲除的多種原理和方法：2.1.1 利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來(lái)的80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)1985 年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型 [1]直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型中最普遍的使用方法 2.1.2條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類(lèi)型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法[2]它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)2.1.2.1條件性敲除的原理利用Cre／LoxP 和來(lái)自酵母的FLP—frt 系統(tǒng)可以研究特定組織器官或特定細(xì)胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型[4]。

通過(guò)常規(guī)基因打靶在基因組的靶位點(diǎn)上裝上兩個(gè)同向排列的1oxP，并以此兩側(cè)裝接上loxP 的(“l(fā)oxP floxed”)ES 細(xì)胞產(chǎn)生“l(fā)oxPfloxed”小鼠,然后，通過(guò)將“l(fā)oxP floxed”小鼠與Cre 轉(zhuǎn)基因鼠雜交(也可以其他方式向小鼠中引入Cre 重組酶)，產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式(如特定的組織特異性)修飾的條件性突變小鼠在“l(fā)oxP floxed”小鼠，雖然靶基因的兩側(cè)已各裝上了一個(gè)loxP，但靶基因并沒(méi)有發(fā)生其他的變化，故“1oxP noxed”小鼠表型仍同野生型的一樣但當(dāng)它與Cre 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交時(shí)，產(chǎn)生的子代中將同時(shí)帶有“l(fā)oxP floxed”靶基因和Cre 基因Cre 基因表達(dá)產(chǎn)生的Cre 重組酶就會(huì)介導(dǎo)靶基因兩側(cè)的1oxP 間發(fā)生切除反應(yīng)，結(jié)果將一個(gè)loxP 和靶基因切除這樣，靶基因的修飾(切除)是以Cre 的表達(dá)為前提的Cre 的表達(dá)特性決定了靶基因的修飾(切除)持性：即Cre 在哪一種組織細(xì)胞中表達(dá)，靶基因的修飾(切除)就發(fā)生在哪種組織細(xì)胞；而Cre 的表達(dá)水平將影響靶基因在此種組織細(xì)胞中進(jìn)行修飾的效率所以只要控制Cre 的表達(dá)特異性和表達(dá)水平就可實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠中靶基因修飾的特異性和程度。

[3]2.1.2.2 誘導(dǎo)性基因敲除法誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cre/loxp 系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre 表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre 酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制或利用Cre 基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)的過(guò)程在時(shí)間上的可控性，從而在1oxP 動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)人們可以通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)的方式來(lái)對(duì)動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象常見(jiàn)的幾種誘導(dǎo)性類(lèi)型如：四環(huán)素誘導(dǎo)型；干擾素誘導(dǎo)型；激素誘導(dǎo)型；腺病毒介導(dǎo)型2.2利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除2.2.1 原理：此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞[5,6]根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同逆轉(zhuǎn)率病毒可用于動(dòng)植物細(xì)胞的插入；對(duì)于植物細(xì)胞而言農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)座子比較常用；噬菌體可用于細(xì)菌基因敲除 2.2.2基因捕獲法基因捕獲法是最近發(fā)展起來(lái)的利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的新型方法。

通?；虿东@載體還包括一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)道基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的ES 克隆可以很容易地在含G418 的選擇培養(yǎng)基中篩選出來(lái)，從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該100％地含有中靶基因中靶基因的信息可以通過(guò)篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來(lái)獲得2.3.RNAi引起的基因敲除由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達(dá)，并且這種效應(yīng)可以傳遞到子代細(xì)胞中,所以RNAi的反應(yīng)過(guò)程也可以用于基因敲除近年來(lái)，越來(lái)越多的基因敲除采用了RNAi這種更為簡(jiǎn)單方便的方法2.3.1 RNAi阻斷基因表達(dá)的機(jī)理雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后，能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，而另一方面雙鏈RNA還能在RdRP （以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶RNA-directed RNApolymerase，RdRP）的作用下自身擴(kuò)增后，再被Dicer酶裂解成siRNASiRNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復(fù)合物形成的蛋白此復(fù)合物同與siRNA互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈。

結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制從21到23個(gè)核苷酸的siRNA到幾百個(gè)核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi，但長(zhǎng)的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯強(qiáng)于短的雙鏈RNA[7]2.3.2 RNAi基因敲除的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用①.比用同源重組法更加簡(jiǎn)便，周期大大縮短②.對(duì)于哺乳動(dòng)物，如對(duì)于一些敲除后小鼠在胚胎時(shí)就會(huì)死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能③.由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達(dá)，它成為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具④.RNAi還被用來(lái)研究在發(fā)育過(guò)程中起作用的基因，如可用RNAi來(lái)阻斷某些基因的表達(dá)，來(lái)研究他們是否在胚胎干細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中其起著關(guān)鍵作用2.4實(shí)現(xiàn)基因敲除的其他原理除上述幾種已經(jīng)比較成熟并且普遍使用了的基因敲除原理外，還有一些基于其他原理的敲除技術(shù)正處于研究和完善過(guò)程中，如TFOs（Triple helix forming oligonucleotides）引導(dǎo)的基因敲除術(shù)以及反義技術(shù)在基因敲除技術(shù)中的運(yùn)用等。

隨著遺傳學(xué)，分子生物學(xué)理論的發(fā)展，新的基因敲除原理也在不斷的發(fā)現(xiàn)和發(fā)掘中3．基因敲除技術(shù)的缺陷隨著基因敲除技術(shù)的發(fā)展，早期技術(shù)中的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但基因敲除技術(shù)始終存在著一個(gè)難以克服的缺點(diǎn)，即敲掉一個(gè)基因并不一定就能獲知該基因的功能，其原因包括：一方面，許多基因在功能上是冗余的， 敲掉一個(gè)在功能上冗余的基因，并不能造成容易識(shí)別的表型，因?yàn)榛蚣易宓钠渌蓡T可以提供同樣的功能；另一方面，對(duì)于某些必需基因，敲除后會(huì)造成細(xì)胞的致死性，也就無(wú)法對(duì)這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究了 4．基因敲除技術(shù)的應(yīng)用及前景：①．建立生物模型在基因功能，代謝途徑等研究中模型生物的建立非常重要基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行相關(guān)的研究這些模型可以是細(xì)胞，也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體最常見(jiàn)的是小鼠，家兔、豬、線蟲(chóng)、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見(jiàn)于報(bào)道②.疾病的分子機(jī)理研究和疾病的基因治療通過(guò)基因敲除技術(shù)可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響這無(wú)論是對(duì)了解疾病的根源或者是尋找基因治療的靶目標(biāo)都有重大的意義③. 提供廉價(jià)的異種移植器官眾所周知，器官來(lái)源稀少往往是人體器官移植的一大制約因素，而大量廉價(jià)的異種生物如豬等的器官卻不能用于人體。

這是因?yàn)楫愒瓷锏幕驎?huì)產(chǎn)生一些能引起人體強(qiáng)烈免疫排斥的異源分子，如果能將產(chǎn)生這些異源分子的基因敲除，那么動(dòng)物的器官將能用于人體的疾病治療，這將為患者帶來(lái)具大的福音如：PPL Therapeutics 公司于1999 年已成功地在豬的體細(xì)胞中用基因敲除技術(shù)敲除了α－1，3GT 基因使每只豬都缺乏產(chǎn)生a１－３半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的２個(gè)拷貝這些酶在細(xì)胞表面產(chǎn)生一種糖分子，人體的免疫系統(tǒng)可以立即辨認(rèn)出這種糖分子為異源性，從而引發(fā)超急性免疫排斥反應(yīng)在缺乏這種酶的情況下，超急性排斥反應(yīng)即不會(huì)再發(fā)生[8]④. 免疫學(xué)中的應(yīng)用同異源器官移植相似，異源的抗體用于人體時(shí)或多或少會(huì)有一定的免疫排斥，使得人用抗體類(lèi)藥物的生產(chǎn)和應(yīng)用受阻而如果將動(dòng)物免疫分子基因敲除，換以人的。