Pierce? Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）中文說明書介紹：Thermo 公司的Pierce?免疫共沉淀試劑盒，可通過將鉚釘抗體固定在瓊脂糖支撐物上，從裂解液中或其他復(fù)雜混合物中，分離出天然蛋白復(fù)合物Co-IP是一種研究蛋白與蛋白相互作用通用的方法，該方法使用一種誘餌蛋白與抗原進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，然后可通過免疫共沉淀任何與誘餌蛋白具有相互作用的獵物蛋白傳統(tǒng)的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脫抗體的重鏈和輕鏈，這很可能導(dǎo)致將相關(guān)的蛋白一起洗脫下來，掩蓋一些重要的結(jié)果Pierce?免疫共沉淀試劑盒通過將共價(jià)結(jié)合抗體固定在一個(gè)胺類活性反應(yīng)樹脂上解決了這一問題該試劑盒包含足夠的用于蛋白結(jié)合和恢復(fù)的緩沖液，完成對(duì)照試驗(yàn)的高校離心柱和收集管，這些產(chǎn)品進(jìn)一步縮短了操作實(shí)驗(yàn)的時(shí)間重要產(chǎn)品信息：略Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟：A.抗體固定注意：以下試驗(yàn)步驟是針對(duì)用無胺和其他載體蛋白稀釋的10-75μg親和純化抗體（參考重要產(chǎn)品信息一節(jié)）根據(jù)實(shí)際使用比例參考這一協(xié)議步驟參考重要產(chǎn)品信息節(jié)表1中的建議抗體用量和樹脂體積用量1.室溫平衡胺連接耦合樹脂（AminoLink? Plus Coupling Resin）和試劑；2.為每個(gè)Co-IP反應(yīng)準(zhǔn)備2ml 1×Coupling Buffer（超純水稀釋20×Coupling Buffer）；3.輕輕渦旋混勻裝有AminoLink? Plus Coupling Resin的瓶子，使其處于懸浮狀態(tài)。

使用大口徑（或剪掉一段槍頭端），添加50μl樹脂懸液到Pierce提供的離心柱中，將離心柱放入微量離心管中，1000g離心1min，棄濾液；4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗樹脂2次，離心棄濾液；5.將離心柱放于紙巾上，輕巧離心柱底部，去除剩余的液體，插上底塞；6.準(zhǔn)備10-75μg親和純化抗體用于結(jié)合蛋白，調(diào)整體積至200μl，使用足夠的超純水和20×Coupling Buffer來制備1×Coupling Buffer例如：添加10μl 20× Coupling Buffer，180μl超純水和10μl濃度為1μg/μl可直接添加含有超純水、20×Coupling Buffer、親和純化抗體的樹脂在離心柱中7.在通風(fēng)廚中，每200μl反應(yīng)體系，添加3μl氰基硼氫化鈉溶液；注：氰基硼氫化鈉屬劇毒物質(zhì)，操作時(shí)要小心并穿戴防護(hù)服8.擰緊離心柱上螺帽，室溫渦旋孵育90-120min，確保漿體在孵育過程中處于懸浮狀態(tài)；9.握緊底塞，擰開并拿走螺帽，將離心柱置于收集管中離心，保存濾液以便驗(yàn)證抗體耦合；10.打開螺帽，添加200μl 1×Coupling Buffer，離心棄濾液，重復(fù)此步驟1次；11. 向離心柱中添加200μl Quenching Buffer，離心棄濾液；12. 將離心柱放于紙巾上，輕巧離心柱底部，去除殘留液體，插上底塞。

在樹脂上添加200μl Quenching Buffer；13. 在通風(fēng)廚中，添加3μl氰基硼氫化鈉溶液，擰緊螺帽；輕輕搖動(dòng)并孵育15min；14.取出底塞，擰開螺帽，將離心柱置于一收集管中，離心棄濾液；15.打開螺帽，采用200μl 1×Coupling Buffer洗脫樹脂，離心再次重復(fù)此步驟；16.用150μl Wash Solution洗脫樹脂6次，每次洗脫后離心；17.不管是進(jìn)行細(xì)胞裂解、Co-IP，還是儲(chǔ)存樹脂，都需要繼續(xù)進(jìn)行下列步驟；18.用200μl 1×Coupling Buffer洗脫樹脂2次，每次需離心；19. 將離心柱放于紙巾上，輕巧離心柱，去除殘留液體，并插入離心柱底部添加200μl 1×Coupling Buffer，系上螺帽，將離心柱置于4℃保存如果長期儲(chǔ)存，需添加sodium azide（疊氮化鈉）至終濃度為0.02%B. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解方案I：單層培養(yǎng)細(xì)胞的裂解1.小心從細(xì)胞中棄掉培養(yǎng)基；2. 采用Modified Dulbecco’s PBS（改良型Dulbecco PBS緩沖液）清洗細(xì)胞1次；3.向細(xì)胞中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer（表2），冰上孵育5min，期間進(jìn)行周期性混勻。

4.轉(zhuǎn)移溶解物于1個(gè)微量離心管中，13000g離心10min ，以便將細(xì)胞碎片制成微球；5.轉(zhuǎn)移上層于1個(gè)新的離心管用于測定蛋白濃度或進(jìn)一步的分析實(shí)驗(yàn)方案II：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的裂解1.1000g 離心細(xì)胞懸液5min，收集細(xì)胞團(tuán)，棄上層；2.用PBS清洗細(xì)胞，使細(xì)胞團(tuán)懸浮起來，1000g 離心5min收集細(xì)胞；3. 向細(xì)胞團(tuán)中添加冰冷的IP Lysis/Wash Buffer；每50mg濕的細(xì)胞團(tuán)使用500μl IP Lysis/Wash Buffer（10：1 v/w）如果使用大量的細(xì)胞，首先向細(xì)胞團(tuán)中加入終體積為10%的IP Lysis/Wash Buffer，移液器上下吹打混勻混合物，再向細(xì)胞懸液中加入剩余體積的IP Lysis/Wash Buffer；4.冰上5min，孵育溶解產(chǎn)物，期間周期性搖蕩；13000g離心10min去除細(xì)胞殘?jiān)D(zhuǎn)移上清于新的離心管中，用于蛋白質(zhì)濃度測定或其他分析實(shí)驗(yàn)C. 使用對(duì)照組瓊脂糖樹脂預(yù)澄清裂解物5.對(duì)于1mg的裂解物，添加80μl的對(duì)照組瓊脂糖樹脂（40μl的固定樹脂）懸浮液到離心柱中；6.離心柱子，以去除存儲(chǔ)液；7. 添加100μl 1×Coupling Buffer于柱中，離心棄掉濾液；8.添加1mg裂解物于含有樹脂的離心柱中，4℃孵育30min-1h;9.1000g 離心柱子1min，棄掉含有樹脂的柱子，保存濾液，它們將被添加到已固定化的抗體中，用于Co-IP實(shí)驗(yàn)。

D. Co-IP所有的Co-IP 實(shí)驗(yàn)步驟均在4℃下完成，除非另有說明誘餌的數(shù)量：如獵物蛋白復(fù)合體的要求、孵育時(shí)間，這些都依賴于體系的使用、抗體的親和力、誘餌與獵物的相互作用，而且每個(gè)體系必須是最佳化的此方案使用IP Lysis/Wash Buffer來耦合和洗滌免疫復(fù)合體試劑盒中提供的20×Modified Dulbecco’s PBS是一個(gè)選擇性的結(jié)合/洗滌緩沖液使用這種緩沖液3作用于復(fù)合物，復(fù)合物有可能會(huì)被洗滌劑破壞對(duì)于每一個(gè)Co-IP反應(yīng)，需要提前用超純水稀釋2ml 1×Modified Dulbecco’s PBS；1.如果互作蛋白是分離的，首先混合誘餌蛋白和獵物蛋白，并準(zhǔn)備好合理的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；2.稀釋誘餌蛋白：獵物蛋白混合物和對(duì)照組使用IP Lysis/Wash Buffer或者其他適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋加入離心柱中的總樣品體積建議為100-500μl；3.添加200μl IP Lysis/Wash Buffer到含有抗體耦合樹脂的離心柱中，清洗2次，離心棄濾液；4. 將離心柱放于紙巾上，輕巧離心柱，去除殘留液體，并插上底塞；5.添加誘餌蛋白：添加獵物蛋白復(fù)合物和對(duì)照組至合適的樹脂中。

擰緊螺帽，4℃輕輕震蕩孵育1-2h，或者過夜；注：優(yōu)化每一次的結(jié)合時(shí)間可能是很有必要的對(duì)于大樣品體積，建議轉(zhuǎn)移抗體耦合的樹脂至一個(gè)分開的含有蛋白復(fù)合物的離心管中孵育結(jié)束后，通過旋轉(zhuǎn)杯分成0.5ml整數(shù)倍進(jìn)行離心，直到全部樣品被處理完6.移開底塞，松開螺帽，將柱子置于收集管中離心，保存濾液以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析用；7.打開螺帽，將柱子置于一新的離心管中，添加200μl IP Lysis/Wash Buffer，離心；8.用200μl IP Lysis/Wash Buffer清洗樣品至少2次，每次清洗完需離心；注：針對(duì)一些特殊的體系，采用A280，SDS-PAGE or Thermo Scientific Micro BCA Protein Assay評(píng)價(jià)洗脫液的蛋白含量，目的是確定最佳洗脫次數(shù)在Co-IP實(shí)驗(yàn)中，最終的洗脫液中應(yīng)該沒有蛋白；對(duì)于樣品中含有高蛋白濃度的洗脫液，增加洗脫次數(shù)或許是非常必要的E. Co-IP的洗脫注：如果蛋白或者抗體對(duì)低pH值比較敏感，使用中性pH值體系（如：Thermo Scientific Gentle Elution Buffer, Product No. 21027）。

針對(duì)下游酶催化或功能測定實(shí)驗(yàn)，應(yīng)添加1M pH為9.5的Tris 5μl到收集管中，這將中和洗脫液的pH值，在基礎(chǔ)上在進(jìn)行離心分離1.將離心柱放入一新的收集管中，添加10μl的洗脫液，離心；2.不要取出柱子，繼續(xù)向柱子中加入50μl洗脫液，室溫孵育5min柱子不需要扣上蓋子或者混勻；注：為了獲得濃度更高的洗脫產(chǎn)物，可使用少量的洗脫液，但是總產(chǎn)量可能會(huì)降低3.離心收集濾液，分析濾液中的蛋白含量再次進(jìn)行D1-D3步驟是非常必要的從每次離心后的濾液中取出一小部分，分別進(jìn)行檢測分析，以確?？乖耆幌疵撓聛?.為了保持抗體耦合樹脂的活性，需即可進(jìn)行F步驟：樹脂的再生與儲(chǔ)存F.樹脂的再生與儲(chǔ)存1. 添加100μl 1×Coupling Buffer于柱中，離心棄掉濾液，重復(fù)此步驟1次；2.將底塞放回離心柱上，向離心柱中添加200μl 1×Coupling Buffer，蓋上螺帽用封口膜封住離心管底部，以防止樹脂干燥如果是長期儲(chǔ)存（比如大于2周），需添加終濃度為0.02%的疊氮化鈉G.關(guān)于SDS-PAGE分析的樣品準(zhǔn)備1.室溫平衡5×Lane Marker Sample Buffer，緩慢上下顛倒樣品緩沖液5-10次。

為縮短凝膠時(shí)間，添加1M DTT于5 ×Sample Buffer中，使終濃度至100mM2.添加5×Sample Buffer至樣品中，制成1×的終濃度（如：添加5μl 5×Sample Buffer到 20μl的樣品中）；3.95-100℃加熱樣品5min，在加樣前，可將樣品置于 室溫中冷卻。